一、Western blot实验介绍

Western Blot（简称WB）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其核心目的是在复杂的样品中，检测目标蛋白质的存在与否，并对其分子量大小和表达量进行半定量分析。简单来说，它的工作原理是：通过凝胶电泳将混合的蛋白质按分子量大小分离开，然后将这些蛋白质转移到固相膜上，最后利用特异性抗体作为探针，来“钓”出并可视化我们的目标蛋白。

二、核心原理三步走的“钓鱼”过程

1、电泳分离（按大小分鱼）： 将混合的蛋白质样品加到聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，通电。在电场作用下，分子量小的蛋白质跑得快，分子量大的跑得慢。经过一段时间，不同大小的蛋白质就在凝胶中分散开了；

2、转膜（换地方）： 凝胶是软而脆的，不适合后续的抗体孵育。因此，我们通过电流，将凝胶中已经分离开的蛋白质条带，原封不动地转移到一张坚固且易于操作的膜上（如PVDF膜或NC膜）。这样，蛋白质就“贴”在了膜表面；

3、免疫检测（用抗体钓目标）：

（1）封闭： 先用牛奶或BSA（牛血清白蛋白）封闭膜上未结合蛋白质的区域，防止抗体非特异性结合，造成背景脏；

（2）一抗孵育： 加入针对我们目标蛋白的特异性一抗（比如抗GAPDH抗体）。一抗会像钥匙一样，专门识别并牢牢结合在膜上的目标蛋白上；

（3）二抗孵育： 洗去未结合的一抗后，加入带有标记酶（通常是辣根过氧化物酶HRP）的二抗。二抗是针对一抗的抗体，相当于一个“放大”和“带灯”的探针；

（4）显色/曝光： 加入化学发光底物，二抗上的酶会催化底物发出荧光。最后，用X光胶片或成像系统记录下这些荧光信号。有信号的地方，就代表有我们的目标蛋白。

三、 详细实验步骤（分阶段）

一个完整的 WB 实验通常需要 1-2 天。

第一阶段：样品制备与蛋白定量

（1）目的： 从细胞或组织中提取所有蛋白质，并测定浓度。

（2）操作： 裂解细胞/组织 

 （2.1）离心取上清（总蛋白） 

 （2.2）BCA 法或 Bradford 法定量蛋白浓度 

 （2.3）用 Loading Buffer（上样缓冲液）制备样品 

（2.4）煮沸变性（使蛋白质展开并带上负电荷）。

第二阶段：SDS-PAGE 凝胶电泳

（1）目的： 按分子量大小分离蛋白质。

（2）操作： 配制浓缩胶和分离胶 

（2.1）将等量蛋白样品加入加样孔 

（2.2）接通电源：浓缩胶用低电压（80-100V）压线，分离胶用高电压（120-150V）跑开 

（2.3）当溴酚蓝（染料）跑到凝胶底部时停止。

第三阶段：转膜

（1）目的： 将蛋白从凝胶转移到膜上。

（2）操作： 按照“黑胶白膜”的原则组装转膜“三明治”（海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵） 

（2.1）放入转膜槽，加满转膜液 

（2.2）冰浴下恒流或恒压转膜（时间根据蛋白大小调整）。

第四阶段：免疫反应

（1）目的： 特异性标记目标蛋白。

（2）操作：

（2.1）封闭： 将膜放入 5% 脱脂牛奶或 BSA 中，室温摇床孵育 1 小时。

（2.2）一抗孵育： 将膜放入稀释好的一抗中，4℃ 摇床孵育过夜（或室温 2 小时）。

（2.3）洗膜： 用 TBST 洗 3 次，每次 10 分钟，去除未结合的一抗。

（2.4）二抗孵育： 将膜放入对应种属的二抗中，室温摇床孵育 1 小时。

（2.5）洗膜： 再次用 TBST 洗 3-5 次。

第五阶段：显影与数据分析

（1）目的： 可视化结果并量化。

（2）操作： 将 ECL 发光液均匀滴加在膜上 

（2.1）放入化学发光成像仪中曝光 

（2.2）保存图片 

（2.3）使用 ImageJ 等软件分析条带的灰度值。

四、结果解读

1、条带位置（分子量）： 观察条带出现在多少 kDa（千道尔顿）的位置，是否与目标蛋白的理论分子量一致；

例如：GAPDH 通常在 36 kDa 左右，β-actin 在 42 kDa 左右。

2、条带特异性： 除了目标条带，是否有多条非特异性条带？可能是抗体特异性不好或蛋白降解；

3、条带强度： 目标条带的粗细和颜色深浅，反映了蛋白表达量的高低；

4、内参： 必须检测内参蛋白（如 GAPDH， Tubulin）的条带。内参条带应该在所有泳道中基本一致，证明上样量是均等的，这样才能校正目标蛋白的差异。

五、常见问题与注意事项

1、“微笑”条带或“皱眉”条带： 通常是因为凝胶配制不均、电压过高或电泳温度过高；

2、背景高，膜上很脏： 封闭时间不够、一抗浓度过高、洗膜不充分、二抗非特异性结合；

3、没有信号或信号弱：

（1）蛋白没转上膜？可以用丽春红染色检查转膜效果；

（2）抗体失效或浓度太低；

（3）目标蛋白表达量极低。

4、多条带： 蛋白降解、磷酸化等修饰、抗体特异性差；

5、安全提示： 实验中会用到有毒或刺激性的试剂（如丙烯酰胺、TEMED、甲醇、强发光液），务必戴手套、在通风橱操作。

六、应用场景

1、基础科研： 研究信号通路（某刺激下蛋白磷酸化水平变化）、验证基因敲除/过表达效果；

2、临床诊断： 如 HIV 确认实验（通过检测病毒特异性蛋白）；

3、生物制药： 检测目的蛋白的纯度与大小。